Equipe 3 – Elise Balse et Sophie Nadaud – Plasticité cellulaire et moléculaire dans les maladies cardiovasculaires

Elise Balse et Sophie Nadaud, responsables de l’équipe 3

Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont des maladies multifactorielles qui partagent souvent des mécanismes physiopathologiques. Les processus de remodelage sont associés à un réarrangement complexe au niveau des tissus et des cellules. Nous visons à comprendre les facteurs de la plasticité moléculaire et cellulaire qui caractérisent le remodelage cardiovasculaire lors de la fibrillation auriculaire (AF), de l’insuffisance cardiaque (IC), de la sénescence cardiaque et de l’hypertension pulmonaire (HP).

Nos projets se concentrent sur :
– la plasticité de la composition cellulaire des tissus cardiovasculaires. Nous étudions notamment la capacité des progéniteurs et des cellules souches à être recrutés, à se différencier dans différentes lignées cellulaires mésenchymateuses et à contribuer au remodelage auriculaire et vasculaire.
– la plasticité des complexes protéiques macromoléculaires régulant la fonction cardiaque et leur rôle dans le dysfonctionnement de la pompe et les arythmies. Nous nous concentrons sur la régulation du trafic des canaux ioniques et leur ciblage dans les cardiomyocytes.
– le rôle des changements du métabolisme cellulaire dans la régulation du remodelage myocardique et des propriétés électriques auriculaires.
– le rôle des cellules immunitaires et inflammatoires lors du remodelage cardiovasculaire conduisant à l’IC. Nous étudions les mécanismes impliqués dans le rôle protecteur des macrophages au cours de l’hypertrophie cardiaque adaptative précoce.
– le rôle du stress oxydatif et de l’inflammation lors du remodelage cardiovasculaire lié à l’âge et de la transition vers l’insuffisance cardiaque.
– le rôle de la mutation du gène GCN2 dans le développement de la maladie pulmonaire veino-occlusive, une forme spécifique d’hypertension pulmonaire.

Projets de recherche
La fibrillation auriculaire et l’insuffisance cardiaque sont les deux principales causes principales de mortalité et de morbidité dans le monde dans les pays modernes et leur prévalence continuera d’augmenter au cours des prochaines années avec le vieillissement de la population. L’hypertension pulmonaire est un trouble cardiovasculaire rare et très sévère, caractérisé par un remodelage occlusif du système vasculaire pulmonaire distal qui conduit finalement à une insuffisance cardiaque droite. Notre équipe 3 s’intéresse à identifier les acteurs moléculaires et cellulaires participant aux processus de remodelage qui conduisent à ces pathologies.

THÈME 1 – Organisation des myocytes, tri et adressage des canaux ioniques – Elise Balse
Contexte scientifique et contributions passées
L’expression fonctionnelle des canaux ioniques dans le sarcolemme détermine la forme, la durée du potentiel d’action, et la période réfractaire effective du cardiomyocyte. L’expression fonctionnelle correcte des canaux ioniques peut être perturbée à différents niveaux tels que les niveaux transcriptionnel, traductionnel et post-traductionnel. Au cours des dernières années, nous avons contribué à mieux comprendre la dynamique de l’expression de surface des canaux ioniques dans les myocytes cardiaques (Balse et al.PNAS 2009, Balse et al., Physiol Rev 2012; Boycott et al., 2013; Eichel et al., Circ Res 2016). Tout d’abord, suite à notre découverte de réservoirs de canaux KV sous le sarcolemme pouvant être rapidement recyclés suite à la déplétion du cholestérol (Balse et al., PNAS 2009; Balse et al., Physiol Review 2012), nous avons montré que la contrainte mécanique déclenche l’exocytose des canaux Kv à partir de ce réservoir par l’activation de la voie de mécanotransduction intégrine/PFAK. Le recyclage des canaux KV1.5 devient constitutif lors d’une surcharge hémodynamique auriculaire, favorisant le raccourcissement du potentiel d’action et l’arythmogenèse (Boycott et al., PNAS 2013) (Figure 1). Dans les biopsies humaines de patients atteints de FA, des modifications drastiques de l’équilibre entre processus d’exocytose et endocytose est altéré, conjointement avec une altération de l’état de polymérisation des microtubules. La prédominance du trafic antérograde sur le trafic rétrograde entraîne une accumulation de canaux KV1.5 dans le sarcolemme au cours du remodelage auriculaire (Melgari et al., JMCC 2020).

Figure 1. L’endosome de recyclage (ER/Rab11) est un compartiment de stockage majeur des canaux KV1.5 dans les myocytes auriculaires et assure une exocytose rapide des canaux sous l’effet d’une modification des contraintes mécaniques.

D’autre part, nous avons caractérisé un nouveau partenaire du principal canal sodique cardiaque, NaV1.5. Contrairement aux autres partenaires identifiés de NaV1.5, la protéine MAGUK CASK régule négativement les pools de NaV1.5 à la membrane latérale en empêchant le trafic antérograde du canal. La protéine CASK est exprimée au costamère, l’adhésion focale des myocytes, et interagit avec la dystrophine au niveau de la membrane latérale (Eichel et al.Circ Res 2016) (Figure 2). Nous avons montré que les domaines L27B et GUK sont nécessaires pour l’effet régulateur négatif de CASK sur le courant sodique et l’expression de surface de NaV1.5. Le domaine HOOK est essentiel pour l’interaction avec le complexe dystrophine-glycoprotéine d’adhésion cellulaire. Ainsi, en raison de sa structure multi-modulaire, CASK interagit simultanément avec plusieurs cibles dans les cardiomyocytes pour réguler le trafic et l’adressage des canaux sodiques au costamére dans les cardiomyocytes (Beuriot et al. Heart Rhythm, 2020).

Figure 2. CASK empêche le trafic antérograde précoce des pools de canaux sodiques localisés à la membrane latérale.

Objectifs scientifiques
Ces résultats suggèrent une interaction continue entre les propriétés électriques de la membrane, l’environnement myocytaire et l’architecture tridimensionnelle du myocarde. Globalement, nous continuerons d’étudier l’organisation spatio-temporelle des canaux ioniques dans les myocytes cardiaques, en relation avec la microarchitecture du tissu dans des conditions normales et malades.
– Tester l’hypothèse d’un centre de tri aux stades précoces du trafic, où les interactions entre les canaux NaV1.5 et les partenaires régulateurs orientent le ciblage final du canal dans les sous-domaines membranaires des myocytes cardiaques.
– Étudier l’exocytose/endocytose régulée localement des canaux ioniques concernant les sites de mécanotransduction dans les myocytes cardiaques.
– Caractériser les altérations des machines de trafic dans les cardiopathies acquises et leur rôle dans la formation du substrat arythmogène.

Importance
Outre une meilleure compréhension des mécanismes généraux du trafic des canaux ioniques et du ciblage dans les myocytes cardiaques, ces études devraient mettre en lumière la plasticité électrique cardiaque dans le contexte des arythmies associées au remodelage structurel du myocarde comme observé dans la plupart des cardiopathies.

THÈME 2 – Mécanismes du remodelage cardiaque au cours du vieillissement : rôle des voies FoxOs et NF-κBs – Sophie Besse et Bruno Riou
Notre groupe s’intéresse, depuis de nombreuses années, aux mécanismes impliqués dans le vieillissement cardiaque et a contribué à identifier les changements structurels du tissu myocardique associés au remodelage électrique et mécanique chez les rongeurs avec l’âge (Figure). La production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO), non contrebalancées par des défenses anti-oxydantes déficientes avec l’âge, a été mise en cause dans ce remodelage. Les ERO, qui agissent en tant que seconds messagers, modulent l’activation / l’inactivation de différents facteurs de transcription tels que NF-κB et FoxOs qui à leur tour régulent de nombreuses voies cellulaires, notamment l’inflammation, la nécrose / nécroptose / apoptose, l’autophagie, l’homéostasie ionique, l’hypertrophie/atrophie myocytaire et le remodelage de la matrice extracellulaire. Différentes études suggèrent que ces facteurs de transcription jouent un rôle central dans la transition de l’hypertrophie cardiaque à l’insuffisance cardiaque à un âge avancé.

L’activation de NF-κB induit une inflammation chronique qui est une caractéristique de l’insuffisance cardiaque et un prédicteur clinique du pronostic global. Cette activation peut être obtenue par deux voies distinctes: la voie canonique (classique et alternative) et la voie non canonique. Différentes études ont proposé que l’activation chronique de NF-kB induite par les lésions myocardiques et/ou le stress oxydant contribue de façon majeure au vieillissement, principalement via la voie canonique, dans différents organismes modèles, mais un antagonisme entre les voies NF-κB et FoxO a été identifié. FoxO3 joue en effet un rôle important dans la protection des cellules contre le stress oxydatif, augmente la durée de vie et réduit l’altération fonctionnelle conduisant à l’insuffisance cardiaque. Chez D. melanogaster, la surexpression de FoxO3 supprime la dysfonction diastolique observée au cours du vieillissement.

Nous étudions actuellement les voies de régulation du stress oxydatif et de l’inflammation, en particulier la signalisation FoxO et NF-κB, dans l’hypertrophie cardiaque au cours du vieillissement chez les rongeurs afin de mieux comprendre les mécanismes responsables de la transition vers l’insuffisance cardiaque à un âge avancé. Nous étudions également ces voies de signalisation NF-κB et FoxO dans le cœur humain qui restent largement à explorer au cours du vieillissement.

THÈME 3 – Cardiomyopathie atriale et physiopathologie de la fibrillation auriculaire – Stéphane Hatem
Plusieurs études cliniques ont établi que l’accumulation de tissu adipeux à la surface auriculaire est un facteur de risque majeur de FA, en particulier lors de troubles métaboliques tels que l’obésité (Hatem JACC 2016). Le groupe de Stéphane Hatem a été le premier à démontrer un lien de causalité entre le tissu adipeux épicardique et la FA. Ils ont identifié des adipokines sécrétées par le tissu adipeux épicardique auriculaire humain (Activine A) qui peuvent induire la fibrose du myocarde auriculaire voisin (Venteclef EHJ 2015). Ils ont décrit comment les infiltrats graisseux deviennent fibreux dans le sous-épicarde auriculaire, un processus de remodelage associé à la FA persistante et médié par une réponse immunitaire impliquant des lymphocytes T (Haemers EHJ 2017). Ils ont découvert que les adipocytes sont dérivés de cellules progénitrices dérivées de l’épicarde.

L’épicarde est réactivé tôt lors de la formation de la cardiomyopathie auriculaire et du substrat de la fibrillation auriculaire.
Le recrutement de cellules issues de progéniteurs épicardiques et pré-engagées spécifiquement dans une différenciation adipocytaire ou fibroblastique peuvent entraîner l’infiltration fibro-graisseuse arrythmogène des couches sous-épicardiques auriculaires.

Le peptide natriurétique sécrété par les myocytes auriculaires en réponse à un stress mécanique est, à faible concentration, un puissant facteur adipogénique pour les progéniteurs épicardiques (Suffee PNAS 2017). Récemment, notre groupe a identifié une sous-population de progéniteurs épicardiques engagés dans la différenciation soit adipocytaire soit fibroblastique et mis en évidence les voies de signalisation qui régissent un tel commutateur (BioRxiv 589705). En collaboration avec les équipes du LIB (laboratoire d’imagerie biomédicale) et en utilisant des algorithmes internes, nous avons établi que la déformation de la paroi auriculaire est corrélée au degré d’infiltration fibro-graisseuse auriculaire qui peut être utilisé comme biomarqueur du substrat de la FA (Hubert Radiology 2018). Nous avons également identifié des séquences d’IRM à haut champ qui permettent l’analyse des infiltrats de tissu adipeux du myocarde (Bouazizi PLoS One 2019).

Remodelage fibrotique (coloration rouge Sirius) de l’épicarde dans des échantillons auriculaires humains.
Épicarde remodelé non fibreux sans (A) ou avec (B) tissu adipeux sous-épicardique et épicarde remodelé fibrotique avec (C) ou sans (D) tissu adipeux sous-épicardique.

Coimmunomarquage pour la périlipine-1 (marqueur adipogénique) et la tomato (marquant les cellules dérivées de cellules épicardiques WT1+) dans les cellules auriculaires de souris nourries avec un régime riche en graisses.
Les flèches indiquent les adipocytes dérivés de l’épicarde coexprimant la tomato et la périlipine.

THÈME 4 – Le rôle des cellules immunitaires et inflammatoires lors du remodelage cardiovasculaire menant à une insuffisance cardiaque – Catherine Pavoine

Contexte scientifique
L’hypertrophie cardiaque (HC) est initialement un processus compensatoire pour optimiser la fonction de la pompe cardiaque. Cependant, elle est progressivement associée à des changements structurels qui deviennent pathogènes, avec la mort des cardiomyocytes, l’induction de réponses inflammatoires exacerbées et la fibrose interstitielle. Ces changements néfastes conduisent finalement à la transition vers l’insuffisance cardiaque (IC). L’activation du système nerveux sympathique joue un rôle déterminant dans l’induction de l’hypertrophie adaptative précoce et son évolution vers le remodelage pathologique. Le remodelage cardiaque est un syndrome inflammatoire complexe, et le rôle bénéfique ou délétère de la signalisation inflammatoire associée à l’hypertrophie adaptative précoce reste à explorer. Des études indiquent que les réponses inflammatoires détectées au stade de l’hypertrophie adaptative précoce et de l’IC sont différentes, affichant des profils divergents de cytokines et de chimiokines. Cependant, la cytokine pro-inflammatoire TNFα participe aux différentes phases du remodelage cardiaque. Dans les années 1990, « l’hypothèse des cytokines » désignait la production excessive de TNFα comme facteur déclencheur majeur de la pathogenèse de l’IC, suggérant que la neutralisation du TNFα serait bénéfique. De manière surprenante, les grands essais cliniques n’ont pas réussi à démontrer un bénéfice des stratégies anti-TNFα. Il est maintenant établi que selon sa signalisation intracellulaire, le TNFα peut également améliorer le remodelage et l’hypertrophie et atténuer l’inflammation et la fibrose.

Rôle protecteur des macrophages via l’axe CX3CL1 / CX3CR1 dans le remodelage hypertrophique adaptatif précoce du coeur.
La stimulation β-adrénergique chronique provoque une expansion des macrophages CD64 + CCR2- LY6C- MHCII-, dépendante de l’axe CX3CL1 / CX3CR1.
Le CX3CL1 et le TNF-α sécrétés par les macrophages cardiaques déclenchent en synergie l’hypertrophie des cardiomyocytes. Ce remodelage cardiaque adaptatif précoce limite l’évolution vers l’insuffisance cardiaque.

En plus de l’hypertrophie des cardiomyocytes, l’hypertrophie cardiaque (HC) est associée à des changements déterminants des autres types de cellules cardiaques non myocytes, y compris les macrophages (Mφ). Le Mφ cardiaque influence l’homéostasie, la réparation et la régénération des tissus. Ils modulent l’HC et l’IC, notamment par la régulation de signaux paracrines pro ou anti-inflammatoires. Cependant, les fonctions des Mφ cardiaques ne sont pas entièrement comprises notamment dans le contexte du remodelage hypertrophique cardiaque dans les maladies d’origine non ischémique. Le groupe de Catherine Pavoine a récemment souligné que les cellules CD11b / c inflammatoires cardiaques exercent un rôle protecteur dans les cardiomyocytes hypertrophiés en favorisant la signalisation dépendante du TNFR 2 et d’Orai3 (Keck M et al., Sci Rep 2019). L’émergence de ce nouveau rôle protecteur paracrine des cellules CD11b / c au cours de l’hypertrophie adaptative précoce améliore la résistance des cardiomyocytes hypertrophiés adultes au stress oxydatif et limite potentiellement l’évolution vers l’IC en réponse à une stimulation β-adrénergique.

Objectifs
Notre groupe cherche maintenant à identifier l’origine et le rôle des macrophages sélectivement amplifiés au stade de l’hypertrophie adaptative précoce par rapport aux cœurs témoins et IC afin de mieux définir leur mécanisme d’action protecteur. Les résultats préliminaires identifient le rôle crucial de l’axe CX3CL1 / CX3CR1 (soumis à publication).
Objectif 1 – En utilisant des approches de cytométrie en flux, transcriptomique, lipidomique et sécrétomique, le groupe identifiera des marqueurs typiques, des gènes, des lipides, des protéines et des chimiokines sécrétées caractérisant les Mφ cardiaques.
Objectif 2 – Nous réaliserons des expériences in vitro et in vivo pour élucider l’impact de ces signaux typiques sur l’hypertrophie et la survie des cardiomyocytes, ainsi que la réponse hypertrophique adaptative précoce et la transition vers l’IC.

THÈME 5 – Plasticité cellulaire et moléculaire pendant le remodelage vasculaire pulmonaire dans l’hypertension artérielle pulmonaire – Sophie Nadaud
Notre groupe s’intéresse aux facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du remodelage vasculaire. Nous étudions en particulier l’origine de nouvelles cellules musculaires lisses produites lors de l’hypertension pulmonaire. Il s’agit d’une maladie rare et dévastatrice sans options curatives, caractérisée par un remodelage occlusif du système vasculaire pulmonaire distal qui conduit finalement à une insuffisance cardiaque droite. Les vaisseaux non muscularisés se recouvrent de cellules musculaires lisses l’épaisseur de la media artérielle est augmentée avec en plus la formation de néointima. Les progéniteurs pulmonaires résidents participent au remodelage vasculaire associé à l’hypertension pulmonaire en générant de nouvelles cellules musculaires lisses. Nous avons identifié des progéniteurs CD34+/PW1+/PDGFRα+ résidents impliqués dans la néomuscularisation précoce observée au cours de l’hypoxie chronique (CH: un modèle pour l’hypertension pulmonaire modérée) (Dierick, Circ Res 2016). Nous avons récemment démontré que la prolifération de ces cellules progénitrices est sous le contrôle de la voie PDGFRα (article en préparation). En collaboration avec C. Guignabert (INSERM U999), nous avons étudié les péricytes NG2 + pulmonaires qui sont également des cellules progénitrices vasculaires activées lors de l’hypertension pulmonaire (Bordenave, ATVB 2020). Nous développons des modèles de traçage de lignage cellulaire pour suivre le devenir de ces cellules progénitrices au cours du remodelage vasculaire associé à l’hypertension pulmonaire. Nous utilisons des modèles de souris transgéniques pour induire ou supprimer l’activité PDGFRα in vivo après l’activation du tamoxifène pour évaluer le rôle de cette voie dans la fonction de ces progéniteurs et dans le remodelage vasculaire induit par l’hypoxie chronique.

Les artérioles pulmonaires sont principalement non muscularisées
et la néomuscularisation est une caractéristique de l’hypertension pulmonaire.
Nos données montrent que les cellules progénitrices vasculaires pulmonaires sont recrutées par activation de signalisation PDGFRα
et se différencient en de nouvelles cellules musculaires lisses suite à la signalisation CXCR4.

Nous étudions actuellement le rôle des altérations métaboliques sur le recrutement des cellules souches vasculaires pulmonaires. Par ailleurs, nous étudions le rôle de la voie PDGFRα et des cellules progénitrices vasculaires dans le remodelage vasculaire systémique lors d’autres troubles cardiovasculaires conduisant à un remodelage vasculaire.

Les cellules progénitrices en culture se différencient en cellules musculaires lisses identifiées par expression SM-MHC (rouge) et α-SMA (vert).

Les cellules progénitrices PW1+ (vertes) sont regroupées autour des vaisseaux (rouges) dans le poumon humain contrôle.

THEME 6 – Cellular and Molecular Mechanisms Underlying Pulmonary Veno-Occlusive Disease Development – Florent Soubrier
Florent Soubrier’s group, in tight link with the clinical genetics laboratory of the campus hospital (Pitié-Salpêtrière hospital) has identified genes involved in the genetic predisposition to pulmonary arterial hypertension (PAH) and pulmonary veno-occlusive disease (PVOD). In 2019, this group has identified BMP10 as a new gene for heritable PAH (PMID: 30578383) and has identified two families presenting with heritable PAH and carrying mutations of the KDR gene encoding VEGFR2 (Eyries et al, in revision 2019). One objective of the group is to identify new predisposing genes and whole genome sequencing is the technique used in selected subjects.

Pathology of heritable PVOD.
(a) septal vein and (b) small vein showing intimal fobrosis and thickening of the vascular wall
From Eyries and al. PMID: 24292273

The group is also investigating the cellular and molecular mechanisms underlying the occurrence of the heritable form of pulmonary veno-occlusive disease (PVOD) due to mutation of the EIF2AK4 gene that this group has identified in 2015 (PMID: 24292273). This gene encodes GCN2, a serine-threonine kinase which is one of the four EIF2α kinase and induces the integrated stress response in the cell in response to amino acid deprivation. GCN2 has important interactions with cellular physiological responses such as autophagy, inflammation and oxidative stress and with other signaling systems such as mTOR. The link between complete loss of GCN2 and PVOD is not elucidated and is the goal of intensive research. Three lines of rats carrying deletions of EIF2AK4 have been obtained through CrispR-CAS9 gene targeting and are used for deciphering, in vivo, the modes of initiation of the disease.

Schematic view of the GCN2 induced activation of integrated stress response.
Amino acid deprivation induces GCN2 dimerization and activation, hence inducing phosphorylation of the α subunit of EIF2 (EIF2a)
which in turn inhibits protein translation and increases ATF4 by a translation mechanism.
ATF4 is a transcription factor that has several transcriptional targets.
During inflammation, there is an amino acid consumption by cell proliferation and that causes GCN2 activation.
Figure from Santos-Ribeiro D (PMID: 29499378)